Трансформація (генетика)

Відео: "Тепер ти в темі -Генетіка "Кастинг Спб трансформація жінки

трансформація - генетична модифікація клітини шляхом введення і подальшої експресії в ній стороннього генетичного матеріалу (ДНК).

Зараз загальна лабораторна процедура в молекулярної біології. У 1944 році ефект був вперше продемонстрований Освальдом Авері, Коліном Маклеодом і Маклін Маккарті, які провели переніс гена до бактерії Streptococcus pneumoniae. Авери, Маклеод і Маккарті назвали таке переніс ДНК і, як наслідок, експресію перенесених генів трансформацією.

Історія відкриття

1928 - Фредерік Гріффіт перетворює непатогенних бактерій Pneumococcus в патогенні, змішуючи їх з убитими патогенними бактеріями.
1944 - Освальд Авері, Колін Маклеод і Маклін Маккарті виявляють, що перетворює чинником є ДНК і називають процес трансформацією.
Трансформація vs. трансфекція

У кожному з цих термінів в сучасній біотехнології є певні нюанси. Історично "трансформація" означала фенотипічні зміни, викликані експресією чужорідного гена в організмі. А процес перенесення чужорідної ДНК називали "трансфекції". Говорили, що трансфекція призводить до трансформації: "the transfection leads to a transformation".

Згодом ці нюанси розмилися і вбудовування чужорідного гена в геном автоматично називається трансформацію. Втім, в тваринної генної інженерії термін, що залишився трансфекція, що означає переніс молекулярного вектора, що містить ген, в клітку, не призводить до вбудовування його в геном. Зате в рослинному біології подібний термін не прижився і в разі перенесення вектора без вбудовування гена в геном називають транзієнтної, тобто тимчасової, трансформації.

У разі бактерій, термін «трансформація» не використовується, якщо генетичні зміни були викликані процесами трансдукції або кон`югації, при яких передача ДНК здійснюється за допомогою бактеріофагів і коньюгаторніх плазмід.

механізми

бактерії

В бактеріях для опису процесів трансформації використовується термін компетентність - стан, коли бактерії мають здатність приймати ДНК із зовнішнього середовища. Існують дві форми компетентності, природна і штучна.



природна компетентність

Бактерії багатьох видів (можливо, більшості) природно здатні до прийняття ДНК. У стані компетентний бактерії виробляють особливий низькомолекулярний білок (фактор компетентності), що активує синтез автолізіну, ендонуклеази і ряду факторів транскрипції. Автолізін частково руйнує клітинну стінку, що сприяє проникненню ДНК через неї, а також знижує чутливість бактерій до осмотичного шоку. У стані компетентності також знижується загальна інтенсивність метаболізму.

Еволюційна функція генів, що кодують вищезгадані ензими, спірна. Хоча більшість підручників і дослідників припускають, що клітини приймають ДНК, щоб придбати нові версії генів, простим поясненням, яке відповідає більшості спостережень, є те, що клітини приймають ДНК переважно як джерело нуклеотидів, які можуть використовуватися безпосередньо або бути метаболізованих і використовуватися для інших цілей . Найчастіше бактерії, природно піддаються трансформації, експресують свої гени компетентності тільки в специфічних умовах, часто у відповідь на харчовий тиск. Як тільки ДНК потрапляє в цитоплазмі клітини, вона часто розрізається клітинними нуклеазами, або завдяки процесу генетичної рекомбінації вона може бути вбудована в бактеріальний геном. Природна трансформація ефективна в разі лінійної ДНК, але не кільцевої ДНК плазмід.

штучна компетентність

Штучна компетентність не кодують в генах клітин. Замість цього, вона викликається лабораторними процедурами, в яких клітини пасивно робляться проникними для ДНК, використовуючи умови, які зазвичай не зустрічаються в природі. Ці процедури порівняно легкі і прості, і широко використовуються в молекулярній біології та генної інженерії бактерій. Штучно компетентні клітини стандартних бактеріальних штамів також виробляються комерційно, їх можна придбати замороженими і готовими до використання.

Охолодження клітин при наявності двовалентних катіонів, наприклад Ca2 + (в CaCl2), робить клітинні мембрани більш проникними до плазмідної ДНК. Бактерії культивуються з ДНК, а потім раптово нагріваються (до 42 ° C протягом 30-60 секунд), що змушує ДНК до проникнення в клітину. Цей метод добре працює для кільцьовоі ДНК плазмід, але не для лінійних фрагментів хромосомної ДНК. Ефективність трансформації для високо компетентних клітин становить близько 108 випадків трансформації на мкг ДНК плазміди. Низько-компетентні клітини дають 104 / мкг або менше. Хороші непромислові підготовки повинні надати 105-106 трансформацій на мкг ДНК плазміди. Максимальна кількість компетентних клітин спостерігається в кінці фази логарітмічного зростання і при подальшому суворому дотриманні низьких температур (4 ° C) середовища при приготуванні клітин.

Електропорація - інший спосіб створення отворів в клітинах, раптово шокуючи їх електричним струмом з напругою 100-200 В / мм плазмідна ДНК може проникнути в клітину через ці отвори. Природні механізми відновлення мембрани згодом латають ці отвори. Особливість цього методу полягає в тому, що середовище, в якому знаходяться клітини, повинні бути обезсолена для запобігання короткого замикання.

Плазміди містять послідовності, які дозволяють їм реплицироваться в клітці незалежно від хромосоми. В експериментах використовуються плазміди, що містять ген стійкості до антибіотиків і бактеріальні штами, які не мають стійкості до цього антибіотика (так звана селекція). Тому, тільки трансформовані бактерії можуть вижити на селективному середовищі з цим антибіотиком. Наприклад, плазміда, що містить ген, що кодує білок -лактамазу (тобто містить bla-ген), робить бактерій стійкі до ампіциліну. Бактерії потім вирощуються на середовищі з ампіциліном, вбиваючи бактерій, які не прийняли bla-ген.

Інший спосіб детекції клітин, які пройшли трансформіцію, - скринінг, тобто використання генів, роблять трансформовані бактерії візуально відмінними. Наприклад, для цього використовується галактозидазної тест або експресія флюоресцентних білків, таких як GFP.

Дріжджі та інші гриби

Відомо кілька методів трансформації дріжджів:



Високоефективна трансформація (High Efficiency Transformation) згідно з протоколом, запропонованого Gietz і Woods [1]
Двох-гібридний протокол (Two-hybrid System Protocol): двох-гібридна система залучає використання двох різних плазмід в єдиній клітині дріжджів. Одна плазміда містить ген або послідовність ДНК, повинні бути внесені в клітини, а інша плазміда містить бібліотеку генома або кДНК (cDNA) [1].
Швидкий протокол трансформацііRapid Transformation Protocol) - див. Посилання на статтю Gietz / Wood вище.
Протокол замерзлих дріжджів (Frozen Yeast Protocol) дозволяє приготування замерзлі клітин дріжджів, компетентних для трансформації після розморожування.
Генетична гармата (Gene Gun Transformation) - бомбардування клітин золотими або вольфрамовими частинками покритими ДНК.
Протопластна трансформація (Protoplast Transformation) - грибні спори можуть бути перетворені в протопластів, який можуть прійнімати ДНК з розчину і трансформуватися.
рослини

Доступні механізми перенесення ДНК в рослинних організмів включають:

Трансформація за допомогою Agrobacterium tumifaciens. Agrobacterium tumifaciens - це природна бактерія, яка паразитує на рослинах і містить спеціальну Ti - плазміду, до складу якої входить Т-ДНК, здатна проникати в клітку рослини господаря і вбудовуватися в геном, а також vir-гени, відповідальні за процес перенесення ДНК. Т-ДНК містить гени синтезу рідких амінокислот і вуглеводів (думок), якими харчується бактерій, а також гени фітогормонів, що викликають опухолевидное зростання рослинних тканин. Рецептори на поверхні бактерії сприймають продукти розкладання рослинної клітинної стінки, в результаті чого активуються vir-гени, продукти яких сприяють процесу переносу Т-ДНК в рослинну клітину. Сама бактерія в рослинну клітину при цьому не потрапляє. Для генетичної трансформації рослинної клітини використовують бінарну веторну систему, що складається з плазміди, що містить Т-ДНК, де гени синтезу думок і пухліноутворюючіх фітогормонів замінені на цільовий ген, який повинен вбудуватися і хелперно плазміди, що містить vir-гени, які обслуговують процес переносу ДНК. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на дрібні шматки, (близько 10x10 мм) і поміщається на 10 хвилин в середу з Agrobacterium, що містить плазміду для перенесення. Здатність рослин утворювати на місці поранення меристематичних тканину, яка за певних умов (фітогормонального складі середовища in vitro) здатна до регенерації і утворює вегетативні пагони з окремих трансформованих клітин. Далі рослини вирощуються на селективному середовищі.
Деякі види рослин можуть бути трансформовані методом in planta шляхом вакуумного "присмоктування" агробактерії до рослинної тканини. Це може бути як стабільна трансформація шляхом зараженням квіток (в такому випадку трансформується ембріональна тканина), а потім посівом насіння на селективне системі або транзієнтної, шляхом вакуумної інфільтрації ДНК в листок.

Генетична гармата, або балістична трансформація: Маленькі золоті або вольфрамові частинки покриваються чужорідною ДНК і вистрілюють в молоді рослинні клітини або ембріони. Деякий генетичний матеріал залишиться в клітинах і трансформує їх. Цей метод також дозволяє трансформацію рослинних органел - пластид. Ефективність трансформації нижче, ніж при трансформації за допомогою Agrobacterium, але більшість рослин можуть бути трансформовані цим методом.
Електропорація: як і з бактеріями, отвори в клітинах рослин робляться, використовуючи електричний струм.
Вірусна трансформація: Генетичний матеріал упаковується в відповідному рослинному вірусі, а потім змінений вірус використовується для інфекції рослини. Геноми більшості рослинних вірусів складаються з одно-ланцюгової РНК, який реплікується в цитоплазмі зараженої клітини. Так цей метод є трансфекції, а не реальною трансформацією, тому що вставлені гени ніколи не досягають ядра клітини і не об`єднують з його геномом. Нащадки заражених рослин вільні від вірусу і від вставленого гена.

тварини

Мікроін`єкція: використання дуже тонкої голки для ін`єкції ДНК безпосередньо в ядро ембріональних клітин.
Вірусна перетворення: Аналогічно випадку з рослинами, генетичний матеріал упаковується у вірусі, який доставляє його в клітини. На відміну від рослин, у тварин цей метод часто призводить до дійсної тансформаціі.

Увага, тільки СЬОГОДНІ!